Реакция с нингидрином

Реакция нингидрина с аминокислотами используется для обнаружения и количественного определения аминокислот.

Нингидрин, являющийся сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование аминокислот, приводящее к образованию СО2, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина (1).

Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытком нингидрина и NН3. При этом образуется продукт сине-фиолетового цвета (2). Протекающие реакции можно записать следующим образом:

гидриндантин (1)

продукт конденсации фиолетового цвета (2)

Ход работы: К 1 мл белка добавляют 2 мл водного 1% р-ра нингидрина и кипятят. Образуется осадок сине-фиолетового цвета.

Дата добавления: 2015-04-30; просмотров: 2291; Опубликованный материал нарушает авторские права? | Защита персональных данных |

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Читайте также:

ЦВЕТНЫЕ И ИМЕННЫЕ КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

История химии в школьном курсе

  • РЕАКЦИЯ ПИОТРОВСКОГО (БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ)

В белках аминокислоты связаны друг с другом по типу полипептидов и дикетопиперазинов. Образование полипептидов из аминокислот происходит путем отщепления молекулы воды от аминогруппы одной молекулы аминокислоты и карбоксильной группы другой молекулы:

Образующаяся группа –С(О)–NН– называется пептидной группой, связь С–N, соединяющая остатки млекул аминокислот, – пептидной связью.

При взаимодействии дипептида с новой молекулой аминокислоты получается трипептид и т. д.

Дикетопиперазины образуются при взаимодействии двух молекул аминокислот с отщеплением двух молекул воды:

Дикетопиперазины были выделены из белков Н.Д.Зелинским и В.С.Садиковым в 1923 г.

Наличие в белке повторяющихся пептидных групп подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного купороса в присутствии щелочи (биуретовая реакция).

Описание опыта.

2–3 мл раствора белка нагревают с 2–3 мл 20%-го раствора едкого кали или натра и несколькими каплями раствора медного купороса. Появляется фиолетовое окрашивание вследствие образования комплексных соединений меди с белками.

  • РЕАКЦИЯ РУЭМАННА (НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ (1911))

a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты.

Реакция идет по схеме:

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.

Описание опыта.

В пробирку наливают 1 мл 1%-го раствора глицина и 0,5 мл 1%-го раствора нингидрина. Содержимое пробирки осторожно нагревают до появления сине-фиолетового окрашивания.

Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина.

Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:

Описание опыта.

В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора a-нафтола.

Спектрофотометрическое определение a-аминокислот в разных условиях проведения реакции с нингидрином

Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.

Это реакция на цистеин и цистин.

При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия.

При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Описание опыта.

В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

При взаимодействии a-аминокислот с формальдегидом образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные, содержащие свободную карбоксильную группу, которую затем титруют щелочью:

Эта реакция лежит в основе количественного определения a-аминокислот методом формального титрования (метод Сёренсена).

Описание опыта.

В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда):

  •   РЕАКЦИЯ Циммермана

Это реакция на аминокислоту глицин.

Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида. Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.

  • ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ С МЕТАЛЛАМИ

a-Аминокислоты образуют с катионами тяжелых металлов внутрикомплексные соли.

Со свежеприготовленным гидроксидом меди(II) все a-аминокислоты в мягких условиях дают хорошо кристаллизующиеся внутрикомплексные (хелатные) соли меди(II) синего цвета:

В таких солях ион меди координационными связями соединен с аминогруппами.

Описание опыта.

В пробирку наливают 3 мл 3%-го раствора сульфата меди(II), добавляют несколько капель 10%-го раствора гидроксида натрия до образования голубого осадка. К полученному осадку гидроксида меди(II) приливают 0,5 мл концентрированного раствора глицина. При этом образуется темно-синий раствор глицината меди:

  • КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

Эта реакция используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы.

Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет.

Описание опыта.

В пробирку наливают 1 мл раствора тирозина и добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. Смесь нагревают до появления желтой окраски.

После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия до появления оранжевой окраски раствора:

  • ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА СОЛЯМИ ТЯЖеЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Описание опыта. В две пробирки наливают по 1–2 мл раствора белка и медленно, при встряхивании, добавляют по каплям в одну пробирку насыщенный раствор сульфата меди, а в другую – 20%-й раствор ацетата свинца.

Образуются осадки труднорастворимых солеобразных соединений белка. Опыт иллюстрирует применение белка как противоядия при отравлении солями тяжелых металлов.

  • Открытие аминного азота в белках

Описание опыта. В сухую пробирку помещают немного сухого белка, например желатины. Прибавляют пятикратное количество натронной извести (смесь едкого натра и гидроксида кальция), перемешивают встряхиванием и подогревают.

Выделяется аммиак, вызывающий посинение розовой лакмусовой бумажки, смоченной водой. Одновременно ощущается запах жженого волоса, что всегда наблюдается при сжигании белковых веществ.

Описание опыта. В пробирку наливают около ~0,5 мл раствора уксуснокислого свинца и прибавляют раствор едкого кали до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца.

В другую пробирку наливают ~2–3 мл раствора белка и приливают такой же объем полученного раствора плюмбита. Нагревают смесь до кипения в течение 2–3 мин. Появление темного окрашивания указывает на образование сульфида свинца.

  • РЕАКЦИЯ НА ПРИСУТСТВИЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ a-АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКЕ

Качественной реакцией на серосодержащие a-аминокислоты является реакция Фоля.

Белки, содержащие остатки цистеина или цистина, также дают эту реакцию.

Описание опыта. В пробирку наливают 10 капель раствора яичного белка и вдвое больший объем 20%-го раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки нагревают до кипения (1–2 мин). К полученному щелочному раствору добавляют 5 капель раствора ацетата свинца(II) и вновь кипятят реакционную смесь.

Наблюдается появление серо-черного осадка.

Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:

По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.

* * *

В ходе проведенного исследования мы выявили по литературным источникам имеющуюся информацию о цветных качественных реакциях на белковые аминокислоты; выполнили ряд перечисленных реакций и составили базу данных.

Эта база может быть использована в школьной практике как в теоретическом плане, так и в практическом, т. к. мы приводим краткие, но подробные описания выполнения всех опытов.

Из предложенных 18 качественных реакций каждая практически осуществима в школьном курсе химии и имеет важное практическое значение. Сопровождение реакций химическими уравнениями конкретизирует и углубляет знания по биологической и органической химии, особенно знания учащихся специализированных биологических и химических классов.

Использованная литература

Ермаков А.Н., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Мирри И.К.

Методы биохимического исследования растений. М.,1952, 520 с.
Полянская А.С., Шевелева А.О. Методическая разработка по лабораторным работам: «Аминокислоты» и «Белки». Л., 1976, 37 с.
Пустовалова Л.М.

Практикум по биохимии. 1999, 541 с.
Руководство к практическим занятиям по органической химии. Под ред. В.М.Родионова.

М., 1954, 111 с.
Соловьев Н.А. Лабораторные работы по биологической химии. Методическая разработка. СПб., 1996, 70 с.
Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М., 1982, 311 с.

З.Саитов, С.В.Телешов, Б.Харитонцев,
секция «Юный химик» РХО им.

Д.И.Менделеева (г. Тобольск)

Качественные реакции на аминокислоты, пептиды, белки

Аминокислоты можно обнаружить с помощью цветных реакций: нингидриновой, ксантопротеиновой, Фоля, Милона, биуретовой пробы и др.

Эти реакции неспецифичны, т.к. основаны на обнаружении отдельных фрагментов в структуре аминокислот, которые могут встречаться и в других соединениях.

Нингидриновая реакция, цветная реакция, применяемая для качественного и количественного определения аминокислот, иминокислот и аминов. При нагревании в щелочной среде нингидрина (трикетогидринденгидрата, С9НбО4) с веществами, имеющими первичные аминогруппы (—NH2), образуется продукт, который имеет устойчивую интенсивную сине-фиолетовую окраску с максимальным поглощением около 570 нм.

Т. к. поглощение при этой длине волны линейно зависит от числа свободных аминогрупп, нингидриновая реакция послужила основой для их количественного определения методами колориметрии или спектрофотометрии. Эта реакция используется также для определения вторичных аминогрупп (>NH) в иминокислотах — пролине и оксипролине; в этом случае образуется продукт ярко-жёлтого цвета.

Чувствительность — до 0,01%. Современный автоматический аминокислотный анализ проводят, сочетая ионообменное разделение аминокислот и количественное определение их с помощью нингидриновой реакции.

При разделении смесей аминокислот методом бумажной хроматографии позволяет определять каждую аминокислоту в количестве не менее 2—5 мкг.

По интенсивности окраски можно судить о количестве аминокислот.

Эта реакция положительна не только со свободными аминокислотами, но и пептидами, белками и др.

Ксантопротеиновая реакция позволяет обнаружить ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан), основана на реакции электрофильного замещения в ароматическом ядре (нитрование).

При действии концентрированной азотной кислоты, например, на тирозин образуется продукт, окрашенный в желтый цвет.

Реакция Фоля. Это реакция на цистеин и цистин.

При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия.

Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

Реакция Циммермана. Это реакция на аминокислоту глицин.

Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида.

Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.

Реакция на триптофан. Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:

По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.

Реакция Сакагучи. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с α-нафтолом в присутствии окислителя.

Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина.

Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра α-нафтола:

Описание опыта.

В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.

Биуретовая реакция – используется как цветная реакция на белки. В щелочной среде в присутствии солей меди(II) они дают фиолетовое окрашивание.

Окраска обусловлена образованием комплексного соединения меди(II), за счет пептидной группы -СО-NH- , которая характерна для белков.

Опыт 5. Реакция глицина с нингидрином.

Свое название эта реакция получила от производного мочевины — биурета, который образуется при нагревании мочевины с отщеплением аммиака:

Кроме белков и биурета такое же окрашивание дают и другие соединения, содержащие -эту группу: амиды, имиды карбоновых кислот, а также соединения, содержащие в молекуле группы -CS-NH- или =CH-NH-. Также реакцию дают белки, некоторые аминокислоты, пептиды, биурет и средние пептоны.

Цвет комплекса, получаемый при биуретовой реакции с различными пептидами, несколько отличается и зависит от длины пептидной цепи.

Пептиды с длиной цепи от четырех аминокислотных остатков и выше образуют красный комплекс, трипептиды – фиолетовый, а дипептиды – синий.

кетонная форма полипептида

енольная форма полипептида

При взаимодействии полипептида с Cu (OH)2 образуется комплекс, строение которого можно показать так:

Дата добавления: 2016-11-04; просмотров: 22631;

Похожие статьи:

В пробирку поместите 4 капли 0,2н раствора глицина и 2 капли 0,1% раствора нингидрина. Содержимое пробирки осторожно нагрейте до появления сине-красной окраски.

Схемы реакций:

Вопросы:

Какие аминокислоты могут быть обнаружены реакцией с нингидрином?

2. Для каких целей может быть использована данная реакция в качественном анализе?

ЗАДАЧИ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО РЕШЕНИЯ

1. При формировании пространственной структуры белковых молекул неполярные радикалы a-аминокислот располагаются внутри макромолекулы, а полярные и ионогенные радикалы-на поверхности. Отнесите следующие аминокислоты к неполярным (гидрофобным) и полярным (гидрофильным); объясните свой выбор: Тре, Цис, Фен, Три, Про, Глн, Сер, Мет, Лей.

Напишите структурные формулы и выберите среди следующих аминокислот положительно и отрицательно заряженные.

НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

Напишите схемы их ионизации в воде:

Асп, Арг, Гис, Глу, Лиз, Асн, Глн, Гли, Тир.

3. В составе природных белков встречаются только L-аминокислоты. Напишите в виде проекций Фишера возможные конфигурационные стереоизомеры для валина, цистеина, изолейцина. Укажите D- и L-стереоизомеры.

4. Для разделения рацемической смеси D- и L-a-аланина его N-ацилированный продукт обрабатывают ферментом ацилазой и извлекают один из энантиомеров водным раствором HCl.

Какой энантиомер образуется под воздействием фермента в растворе в свободном, не ацилированном виде? Напишите реакцию его образования и взаимодействия с HCl.

Метионин (рКа 5,75) и гистидин (рКа 7,58) используют для лечения и предупреждения заболеваний печени. Пользуясь значениями рКа, определите, в какой ионной форме будут находиться перечисленные аминокислоты в крови (рН 7,3-7,5).

Незаменимые аминокислоты триптофан (рКа 5,88) и лизин (рКа 9,74) должны поступать в организм человека с пищей. Пользуясь значениями рКа определите, в какой ионной форме они присутствуют в желудке (рН~1) и в крови (рН 7,3-7,5).

7. Для белкового питания больным внутривенно вводят препарат «Полиамин», состоящий из 13 аминокислот, в том числе аргинина (рКа 10,76) и лейцина (рКа 5,98). Пользуясь значениями рКа, определите, в какой ионной форме будут находиться перечисленные аминокислоты в крови (рН 7,3-7,5).

Тиольная группа цистеина является одной из наиболее реакционноспособной в белках и особенно сильно подвергается модификации. Для выяснения ее роли в проявлении активности ферментов проводят модификацию тиольной группы путем алкилирования йодуксусной кислотой (I-CH2COOH) и йодацетамидом (I-CH2CONH2). Напишите уравнения реакции, назовите реакционные центры, которые участвуют в этом процессе, тип и механизм реакции.

Модификация остатков аминокислот помогает определить их локализацию, либо участие в выполнении биологической функции. В частности ацилирование с помощью радиоактивно моченого уксусного ангидрида было предложено в качестве метода определения локализации остатков лизина, расположенных на поверхности белковой глобулы. Напишите схему реакции ацилирования.

10. Сложные эфиры a-аминокислот обладают летучестью и используются для разделения a-аминокислот методом газожидкостной хроматографии.

Напишите схему образования сложного эфира треонина, укажите тип и механизм реакции, опишите ее механизм.

11. При участии ферментов декарбоксилаз в организме аминокислоты декарбоксилируются с образованием биогенных аминов. Напишите схемы реакций декарбоксилирования гистидина и триптофана.

Назовите продукты реакций, опишите их биологическую роль.

12. В количественном анализе аминокислот применяется метод Ван-Слайка и метод Серенсена. Напишите схемы реакций лежащих в основе этих методов.

13. Образование фенилтиогидантоиновых производных аминокислот используется для установления структуры пептидов.

Напишите схемы реакций получения таких производных для валина и аспарагиновой кислоты. Укажите реагент.

14. Качественная реакция на ароматические аминокислоты – ксантопротеиновая реакиця – основана на образовании нитросоединений под действием азотной кислоты. Напишите схему реакции нитрования тирозина. Укажите механизм реакции.

15. На начальных стадиях биосинтеза кофермента А (HS-KoA) аспарагиновая кислота декарбоксилируется до b-аланина, который образует амид с пантоевой (2,4-дигидрокси-3,3-диметилбутановой) кислотой – пантотеновую кислоту.

Напишите схемы реакций.

16. Трансаминирование – основной путь биосинтеза a-аминокислот, которое осуществляется с участием ферментов трансаминаз (аминотрансфераз) и кофермента пиридоксальфосфата. В этом процессе пиридоксальфосфат играет роль посредника при передаче аминогруппы от a-аминокислоты к оксокислоте. Напишите все схемы реакций, протекающих с участием пиридоксальфосфата в процессе трансаминирования цистеина с участием a-оксоглутаровой кислоты.

По наличию или отсутствию аланинтрансаминазы в сыворотке крови больного инфарктом миокарда можно судить о результатах лечения. К сыворотке крови добавляют a-аланин и a-оксоглутаровую кислоту. Какие продукты образуются, если аланинтрансаминаза присутствует?

У детей страдающих фенилкетонурией в крови (и моче) повышено содержание фенилаланина и продуктов его превращения, которые образуются при последовательном трансаминировании фенилаланина с образованием оксокислоты (А), восстановлении (А) с образованием гидроксикислоты (В), декарбоксилировании (В) с образованием продукта реакции (С). Небольшая часть (С) окисляется до соответствующей кислоты, которая экскретируется с мочой в виде комплекса с глутамином.

Напишите схемы последовательного превращения фенилаланина при фенилкетонурии. Назовите промежуточные продукты.

19. Допишите следующие реакции метаболизма аминокислот:

трансаминаза

а) аргинин + a-оксоглутаровая кислота

трансаминаза

б) валин + a-оксоглутаровая кислота

декарбоксилаза

в) лейцин

дегидрогеназа

г) пировиноградная кислота +НАД Н+ + NH3

Катаболизм валина в организме человека включает следующие стади (в указанном порядке):

1) Трансаминирование, приводящее к образованию a-оксокислоты (А).

2) Окислительное декарбоксилирование (А) в присутствии HS-КоА, приводящее к образованию тиоэфира (Б).

3) Дегидрирование (Б) с образованием ненасыщенного производного (В).

4) Гидратация (В) против правила Марковникова с образованием (Г).

5) Гидролиз тиоэфира (Г) с образованием свободной кислоты (Д).

6) НАД+ зависимое окисление первичноспиртового гидроксида вещества (Д) с образованием альдегидокислоты (Е) и т.д.

Напишите эти реакции и назовите промежуточные продукты.

ЗАНЯТИЕ 15.

ПЕПТИДЫ И БЕЛКИ.

ЦЕЛЬ:Сформировать знания:

– принципов структурного построения пептидов и белков;

– первичной структуры пептидов и белков, методов ее определения;

– пространственной организации полипептидной цепи;

– кислотно-основных свойств и гидролиза пептидов;

– синтеза пептидов in vitro.

Cформировать умения:

– писать структуру ди- и трипептидов, используя знания формул a-аминокислот;

– определять изоэлектрическую точку пептидов;

– изображать разные ионные формы пептидов в зависимости от рН среды;

– выполнять характерные и качественные реакции на пептиды и белки.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

Биологические функции пептидов и белков.

2. Принцип структурного построения пептидов и белков. Электронное строение и свойства пептидной связи.

Свойства пептидов. Изоэлектрическое состояние и изоэлектрическая точка пептидов, кислотный и щелочной гидролиз пептидов.

4. Первичная структура пептидов и белков. Определение аминокислотной последовательности по Эдману (фенилизотиоцианатный метод).

5. Синтез пептидов in vitro методом «активации» и «защиты» функциональных групп.

Понятие о стратегии пептидного синтеза.

6. Вторичная структура пептидов и белков. Регулярные a-спиральные и b-структурные участки полипептидных цепей. Понятие о третичной и четвертичной структурах белков.

7. Понятие о сложных белках.

Гемоглобин, строение, свойства, значение.

ЛИТЕРАТУРА:

[1]. Тюкавкина Н.А., Биоорганическая химия. / Н.А.Тюкавкина, Ю.И. Бауков– М.: Медицина, 1991.– С.

[2]. Гидранович Л.Г. Биоорганическая химия: Учеб. пособие. /Л.Г.Гидранович. – Витебск: ВГМУ, 2009.– С.

[3]. Гидранович Л.Г. Лабораторные занятия по биоорганической химии.: Учеб. пособие / Л.Г.Гидранович. – Витебск: ВГМУ, 2012.– С.107-113.

[4]. Гидранович Л.Г. Курс лекций по биоорганической химии.– Витебск.– 2003.– С. 197-210.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ САМОПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ.

1. Подготовить теоретический материал по вопросам для самоподготовки к занятиям.

Оформить протокол лабораторной работы.

3. Решить задачи 1-6,9,14, представленные на страницах 111-113 данного лабораторного практикума.

Примерный вариант заключительного контроля:

Напишите ионные формы дипептида Гис-Про при рН 1,0 и 7,5.

2. Напишите схемы реакций, обозначьте графически действующие реакционные центры, укажите, где возможно, тип и механизм реакций:

СОДЕРЖАНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ПРАКТИКУМА.



Нингидриновый реактив легко окисляется и темнеет при освещении и контакте с воздухом. Его следует хранить на холоду, в темноте и под азотом. Даже максимально короткие трубки подачи реактива приходится с помощью специального покрытия защищать от диффузии воздуха через их стенки. Для восстановления нингидрина в реактив иногда добавляют хлорид олова. От него в трубках постепенно накапливается нерастворимый осадок.
Приготовление нингидринового реактива: в сосуд из оранжевого стекла вместимостью 1 л помещают 375 мл монометилового эфира этиленгликоля ( ТУ 6 — 09 — 08 — 4398 — 77), прибавляют 125 мл натрий-ацетатного буферного раствора рН 5 5, при перемешивании на магнитной мешалке пропускают азот в течение 10 мин, затем прибавляют 10 г нингидрина и вновь пропускают азот в течение 10 мин, продолжая перемешивание на магнитной мешалке до полного растворения нингидрина.

После этого прибавляют 0 19 г олова двухлористого 2-водного и перемешивают.
Приготовление нингидринового реактива: 40 мг SnQ2 2Н2О растворяют в 25 мл цитратного буферного раствора и добавляют 4 0 мг нингидрина, предварительно растворенного в 12 5 мп метилцеллозольва.
Проявление проводят нингидриновым реактивом. Затем стеклянную пластинку с адсорбентом нагревают в сушильном шкафу 30 мин при 110 С.
Хрома-тограмму амина проявляют нингидриновым реактивом, причем после смачивания нингидрином нужно нагревать бумагу 5 мин при 105 С для получения интенсивной фиолетовой окраски.
Схема нингидринового анализатора, изготовленного из автоанализатора фирмы Technicon Chromatography Co.

Далее к пробе добавляется нингидриновый реактив, аналогичный по составу, описанному на стр.
Для определения пролина готовят нингидриновый реактив, содержащий 40 мл 6 М Н3Р04, 60 мл ледяной уксусной кислоты и 2 5 г нингидрина на каждые 100 мл смеси.

Для растворения нингидрина эту смесь нагревают до 70 на водяной бане.
Схема нингидринового анализатора, изготовленного из автоанализатора фирмы Technicon Chromatography Co. Далее к пробе добавляется нингидриновый реактив, аналогичный по составу, описанному на стр.
Последнее затруднение удалось преодолеть, применяя нингидриновый реактив, содержащий хлористое олово.

Важной особенностью работы автоматического аппарата является исключительно постоянный фон: 0 001 единиц оптической плотности до и после каждого пика. Уже с 1 / 10 мкмоль растворенного вещества можно получать удовлетворительные результаты; ввиду отличной воспроизводимости объемов вытекания удается идентифицировать компоненты смеси, присутствующие в низких концентрациях.
Применение тонкослойной хроматографии для проверки препаративного разделения на колонках ( с разрешения Am.

Chem. Soc.. Перешедшее на нее небольшое количество аминокислот элюировали нингидриновым реактивом. Разделенные на секции зоны анализировали далее методом ТСХ.
Розен [16] усовершенствовал методику Пье и Моррис [30], внеся некоторые изменения в состав нингидринового реактива, позволяющие получать более стабильные результаты и к тому же упрощающие методику.
Фактический предел детектирования ниже и до некоторой степени зависит от условий высушивания после нанесения нингидринового реактива.

Пробу ( 0 5 мл), если необходимо, разбавляют буфером еще до 2 мл и смешивают с 2 мл нингидринового реактива.
Петри; 7) NaHCO3; 8) 5 % — ная PbNO3 или РЬ ( СН3СОО) 2; 9) реактив Сальковского; 10) реактив Эрлиха; 11) нингидриновый реактив; 12) реактив Несслера; 13) гумусная почва; 14) свежие листья люпина или засушенные листья других бобовых; 15) рыбная, мясная мука или кусочки мяса, рыбы.
Цакапать культуральный раствор на фильтровальную или хро-матографическую бумагу микропипеткой с оттянутым носиком ( 10 — 20 капель в одну точку), подсушить над вентилятором, капнуть реактива Сальковского, Эрлиха или нингидринового реактива.

Реактив Эрлиха дает с индольными производными пурпурное окрашивание.
Два метода синтеза аминокислот. Удобной цветной реакцией на аминокислоты является взаимодействие с нингидрином ( рис. 12.5); продукт реакдки сильно сопряжен и поэтому интенсивно окрашен. Нингидриновый реактив используют для обнаружения аминокислотных пятен при хроматографии на пластинках или на бумаге, а также для колориметрического количественного определения аминокислот.
Элюирующие буферные растворы отводятся из запасных бутылей через приспособление для деаэрации и нагнетаются через ионообменные колонки с постоянной скоростью.

Нингидриновый реактив подается насосом в оттекающий поток в точке А, смесь элюата с нингидрином проходит по спирали из тефлона через кипящую водяную баню для развития окраски, образующейся при взаимодействии аминокислот с нингидрином. Величины экстинкции окрашенного раствора непрерывно измеряются в фотометрической установке с самопишущим прибором, / — масло; 2 — присоединение к водяной бане ( 50); 3 — давление воздуха 25 см; 4 — ионообменные колонки; 5 — резервуар для нингидрина; 6 — азот; 7 — воздух; S — масло; 9 — хронометр для соленоида; 10 — указатель уровня; / / — полка, расположенная выше деаэратора на 20 см; 12-деаэратор; 13 — кран, регулируемый соленоидом; 14-насос 1; 15 — насос 2; 16 — насос 3; 17 — многоходовой кран; 18 — резервуар для буфера; 19 — нагреватель; 20 -змеевик из тефлона; 21 — фотометр; 22 -сток к сливу; 23 — измерительные приборы; 24 — измеритель скорости тока; 25-воздушное давление 10 см; 26 — счетчик времени; 27 — регистрирующий аппарат-самописец.
Наряду с нингидриновым реактивом существуют и другие реагенты, дающие цветные продукты с некоторыми аминокислотами.

Это свойство избирательного окрашивания часто используют в хроматографии для идентификации отдельных аминокислот. Так, для определения соединений с гуанидиновой группой ( аргинин) используют реакцию Сакагуши.
По этому методу смесь пептидов наносится в центре листа хроматографической бумаги, проводится электрофорез в буфере с рН 3 6 или 6 5, полученная полоса обрабатывается парами надмуравьиной кислоты для перевода остатков полуцистина в цистеиновую кислоту, и затем повторно проводится электрофорез в тех же условиях, но в перпендикулярном направлении.

При проявлении полученной карты нингидриновым реактивом пептиды, содержащие цистеиновую кислоту, обнаруживаются за пределами диагонали.
Реакция окрашивания идет по описанной схеме для всех аминокислот, кроме пролина, который является иминокислотой.

Однако пролин тоже реагирует с нингидриновым реактивом, образуя достаточно окрашенный продукт с неявно выраженным максимумом поглощения при 440 нм. В связи с этим современные аминокислотные анализаторы оснащаются денситометрами, регистрирующими поглощение раствора ( после реакционной спирали) одновременно на двух длинах волн: 570 и 440 нм.
Метод определения остатков акрекса и каратана, предложенный М. А. Клисенко и А. М. Шмигидиной ( ВНИИГИНТОКС), основан на выделении органическим растворителем, его отгонке и хроматографировании в тонком слое силикагеля КСК с цинковой пылью.

Пятна обнаруживают восстановлением продуктов до аминосоединений, проявляющихся нингидриновым реактивом.
NaOH и содержимое их высушивают в вакууме в течение ночи. После этого в пробирки вливают по 1 мл уксусной кислоты и по 1 мл нингидринового реактива. Содержимое пробирок нагревают на водяной бане при 100 в течение 1 часа, в пробирки добавляют по 1 мл уксусной кислоты и охлаждают до комнатной температуры. После этого розовую жидкость переносят в другие пробирки и остатки пигмента экстрагируют из бумаги ледяной уксусной кислотой.

Определение оптической плотности проводят на спектрофотометре при 515 М х или на фотоэлектроколориметре ФЭК-М при синем светофильтре по сравнению с контролем. Для приготовления контрольных растворов используют кусочки бумаги, вырезанные из тех же участков хроматограмм, что и определяемые пятна пролина.

После подогревания пробирок устойчивая розовая окраска сохраняется лишь в течение часа, поэтому колориметрирование необходимо проводить в течение этого времени.
Распределение аминокислот и других важных аминосоединений показано на фиг.

В 18 случаях нанесенные на бумагу аминокислоты обнаруживались при спектрофотометрическом определении при помощи модифицированного нингидринового реактива ( см. стр. Для глицина и серина после хро-матографирования в обратном направлении вырезанного участка хроматограммы, проявленной растворителем П — Э — ФФ, были получены фотометрические отсчеты, составляющие соответственно 82 и 75 % величин, найденных при прямом анализе образцов.
Метод основан на экстракции пестицида из исследуемой пробы органическим растворителем, отгонке растворителя, хроматогра-фировании пробы в тонком слое силикагеля КСК с цинковой пылью.

Обнаружение зон локализации препаратов на пластинке производится при нагревании восстановлением их до аминосоединений и проявлением последних нингидриновым реактивом. Метод специфичен для определения акрекса и кара-тана. Другие нитрофенолы определению не мешают.
Прибор и бумажный диск для круговой хроматографии.

В ряде случаев для сохранения окраски уже проявленную хроматограмму опрыскивают вторым реагентом или вводят соответствующее соединение в первоначальный раствор реагента-индика тора. Например, при детектировании пятен аминокислот нингидри-ном образуются пурпурные пятна, выцветающие при комнатной температуре в течение одного дня.

Если в исходный нингидриновый реактив ввести ацетат кадмия или после детектирования нингидри-ном опрыскать пятна раствором ацетата никеля, окраска сохраняется пять лет.

Задержанные на колонке аминокислоты снимали 80 мл 2 N раствора аммиака и концентрат упаривали досуха на водяной бане.

Сухой остаток переносили двумя миллилитрами воды, одним миллилитром нингидринового реактива и 5 мл бутилового спирта в реакционную колбочку емкостью 50 — 100 мл, добавляя две капли насыщенного раствора хлорида кадмия. Содержимое колбочки нагревали в кипящей воде ровно 15 мин.
В этой работе описывается применение автоанализатора для хроматографического разделения аминокислот. В автоанализатор вводится как один из блоков разделительная колонка с ионообменной смолой.

Пропорциональный насос автоанализатора используется для прокачивания элюирующего раствора через колонку, подачи нингидринового реактива и циркуляции воды через рубашку разделительной колонки для ее термостатирования.

Нингидриновая реакция

В проточном реакторе автоанализатора проводится нингидриновая реакция.
Фотометрируемый раствор подается через кювету снизу вверх, так как это облегчает выход пузырьков воздуха, попавших в кювету из раствора. Указанное количество смолы пригодно для освобождения от NH3 18 л буфера, после чего смолу необходимо регенерировать раствором NaOH. Для этого пришлось пойти на двойной по сравнению с методом Штейна и Мура расход нингидринового реактива ( 30 мл / час вместо 15 мл / час), в котором, однако, для улучшения растворимости продуктов реакции несколько уменьшено содержание метилцеллосольва.

Этого количества хватает на 4 полных анализа.
КУ-2 в Н — форме со скоростью 10 — 12 капель в 1 мин. Затем аминокислоты снимают 80 мл IN раствора аммиака ( 5 — 6 капель в 1 мин.

Полученный осадок 2 мл дистиллированной воды ( в 3 — 4 приема) переносят в реакционную колбочку емкостью 50 мл с притертой пробкой, добавляют 1 мл нингидринового реактива, 1 — 2 капли насыщенного раствора хлорида кадмия и 5 мл бутилового спирта. Стеклянную пробку колбочки закрепляют слабыми резиновыми кольцами и помещают точно на 15 мин.

После охлаждения смесь переносят в градуированную центрифужную пробирку, в которую налит 1 мл раствора сегнетовой соли; спир-ювый слой доводят до 6 мл, содержимое пробирки встряхивают ( при этом кадмиевый комплекс разрушается и красная окраска спиртового раствора переходит в сине-фиолетовую) и центрифугируют.
Содержимое колбы после отгонки хлороформа растворяют в 0 2 мл н-гексана или диэтилового эфира и при помощи капиллярной пипетки наносят на пластинку.

Операцию повторяют 3 — 4 раза, каждый раз нанося раствор в центр первого пятна так, чтобы диаметр его не превышал 1 см. Рядом с пятном пробы ( слева и справа) на расстоянии 2 см наносят на пластинку стандартный раствор, содержащий предполагаемое в пробе количество пестицидов. После подъема фронта растворителя на высоту 10 см хроматографирование прекращают, пластинку помещают в вытяжной шкаф на 5 — 10 мин для удаления паров растворителя, обрызгивают до влажного состояния нингидриновым реактивом и помещают в сушильный шкаф с температурой 100 С на 5 — 7 мин.

Количественное определение препаратов производят визуальным сравнением размера и интенсивности окраски пятна ядохимиката пробы с пятнами стандартного раствора.
Фотометрируемый раствор подается через кювету снизу вверх, так как это облегчает выход пузырьков воздуха, попавших в кювету из раствора.

Перед использованием к буферному раствору прибавляют тиодигликоль ( 5 мл. Указанное количество смолы пригодно для освобождения от NH3 18 л буфера, после чего смолу необходимо регенерировать раствором NaOH. Для этого пришлось пойти на двойной по сравнению с методом Штейна и Мура расход нингидринового реактива ( 30 мл / час вместо 15 мл / час), в котором, однако, для улучшения растворимости продуктов реакции несколько уменьшено содержание метил целлосольва.

Этого количества хватает на 4 полных анализа.
Стальная колонка высокого давления размером 0 32 X 30 см заполнена фирменным обменником В ТС 2712 со средним размером зерен 8 мкм. Колонка расположена внутри электронагревателя ( 8), снабженного вентилятором ( 21) для быстрого ее охлаждения.

На выходе колонки располагается смеситель ( 9), куда из находящейся в охлаждаемом отсеке бутыли ( N) с помощью насоса ( 11) подается нингидри-новый реактив. Скорость подачи регулируется микрометрическим винтом. Поскольку этот насос подключен к выходу колонки на стороне атмосферного давления, во избежание подтекания нингидринового реактива при выключении прибора клапан ( 10) перекрывает поступление реактива в насос.

Вам также может понравиться

Об авторе admin

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *